Туберкулез

Туберкулез - хроническая инфекция с длительным периодом выделения возбудителя, многообразием клинических проявлений, поражением различных органов и систем - представляет непростую задачу для лабораторной диагностики. Молекулярно-биологические методы (ПЦР) используются для выявления, видовой дифференциации и определении лекарственной устойчивости микобактерий туберкулезного комплекса. 

Ввиду биологических особенностей возбудителя и иммунного ответа человека диагностика туберкулеза не может ограничиваться каким-либо одним методом и должна проводиться комплексно. 

Выбор, предобработка биоматериалов.

Возбудители туберкулеза могут быть обнаружены в различных биоматериалах, природа которых определяет выбор наборов реагентов для экстракции ДНК. Ключевой принцип выбора биоматериала для диагностики туберкулеза методом ПЦР: необходимо выбирать биоматериал, соответствующий клинической форме туберкулезной инфекции. 

Например, для диагностики туберкулеза мочеполовой системы нужно исследовать мочу или менструальную кровь, рекомендуется также исследовать биоптаты из подозрительного очага. Для диагностики туберкулеза легких используется мокрота, бронхо-альвеолярный лаваж.

Выявление микобактерий туберкулезного комплекса

Набор реагентов АмплиСенс® МТС-FL предназначен для обнаружения ДНК микобактерий туберкулеза – Mycobacterium tuberculosis complex (MTC), включающий в себя виды микобактерий разной степени вирулентности, вызывающих туберкулез у человека (M.tuberculosis, M.bovis, M.africanum, M.microti, M.canetti, М.pinipedii). Данный набор реагентов используется в топической диагностике туберкулеза и позволяет быстро (за несколько часов) с высокой чувствительностью и специфичностью (близким к 100%) определять наличие микобактерий туберкулеза в образце биоматериала. Благодаря высокой скорости и информативности в диагностике туберкулеза, методы амплификации нуклеиновых кислот (в том числе ПЦР) в 2010 году были предложены CDC США для подтверждения диагноза туберкулеза наряду с культуральным методом.

Видовая дифференциация микобактерий туберкулеза методом ПЦР

Не менее важно дифференцирование до вида внутри группы MTC. Это связано с необходимостью определения источника заболевания, определения тактики противотуберкулезной терапии, а также для подтверждения случаев поствакцинальных осложнений.  С этой задачей позволяет справиться набор реагентов АмплиСенс® МТС-diff-FL, предназначенный для дифференцирования видов микобактерий туберкулеза внутри MTC: человеческого (M.tuberculosis), бычьего (M.bovis) и вакцинного штамма (M.bovis BCG) – в клиническом материале и культурах микроорганизмов.

Актуальность видовой дифференциации определяется, например, тем, что разные виды микобактерий отличаются профилем лекарственной устойчивости. Например, M.bovis и её вакцинный штамм M.bovis BCG отличаются природной резистентностью к одному из основных противотуберкулезных препаратов - пиразинамиду. Поэтому при туберкулезе, вызванной M.bovis, и БЦЖите пиразинамид не назначается. 

Видовая дифференциация микобактерий туберкулеза имеет особую ценность в диагностике БЦЖита (осложнений от введения вакцины БЦЖ). Несмотря на то, что в МР № 99/219 «Диагностика поствакцинальных осложнений после введения вакцины БЦЖ» сказано, что использование предложенного диагностического комплекса (культуральное исследование + ИФА для обнаружения антигена) позволяет в 100% случаев верифицировать диагноз БЦЖит, очевидно, что данные методы не позволяют дифференцировать M.bovis от ее вакцинного штамма M.bovis BCG. 

Приказом Минздрава РФ от 21.03.2003 № 109 "О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации" (ред. от 29.10.2009) регламентировано применение наборов реагентов, дифференцирующих M.bovis от ее вакцинного штамма M.bovis BCG, для диагностики БЦЖита.

Взятие, транспортирование и хранение исследуемого материала.

1. Бронхо-альвеолярный лаваж (БАЛ) или промывные воды бронхов (ПВБ), ликвор собирают в одноразовые плотно завинчивающиеся емкости из полипропилена   (во   избежание   адгезии   клеток   на   внутренней   поверхности емкости) объемом не менее 5 мл.
2. Мокроту, мочу (среднюю порцию) собирают в одноразовые градуированные завинчивающиеся емкости с широким горлом объемом не менее 50 мл.
3. Кровь, плевральную жидкость собирают в пробирки типа Vacuette с раствором или напылением ЭДТА. Закрытую пробирку с материалом несколько раз переворачивают,   чтобы   перемешать   консервант.   Для   анализа   используют цельную кровь, собранную у пациента утром натощак.
4. Менструальную кровь собирают с помощью колпачка Кафка, собранную кровь переносят в сухую одноразовую пробирку.
5. Синовиальную жидкость собирают в сухую одноразовую пробирку.
6. Секрет предстательной железы получают одним из двух способов: а)  После  окончания  массажа  предстательной  железы  ее  секрет  собирают  в одноразовую стерильную пробирку объемом 1,5 мл; б) При невозможности получить секрет – сразу после массажа собирают первую порцию мочи (в которой содержится секрет предстательной железы).
7. Тканевой (биопсийный и операционный) материал помещают в пробирки типа Vacuette   с  напылением  раствора  ЭДТА  или  в  одноразовую  пробирку, содержащую 0,2 мл стерильного физиологического раствора.
8. Культуры микроорганизмов, выросшие на селективных для микобактерий туберкулеза питательных средах.
9. Смывы   с   объектов   окружающей   среды   берут   зондами   с   тампонами, смоченными стерильным физиологическим раствором. Площадь смыва с плоской поверхности составляет 5-10 см2. Рабочую часть зонда с тампоном помещают в пробирку объёмом 1,5 мл с 0,5 мл стерильного физиологического раствора, верхнюю часть зонда отламывают и удаляют.

Хранение материала (в случае отсроченного выполнения анализа, резервирования   материала   для   возможной   перестановки,   а   также   хранения архивных образцов) возможно по следующей схеме: предполагаемое хранение в течение 3 суток (кроме мочи) – допускается температура от 2 до 8 °С; хранение не более  1  года  -  допускается  температура  не  выше минус  16 °С;  архивирование образцов на срок более 1 года – температура не должна превышать минус 68 °С. Мочу  хранить  при температуре  от  2  до  8 °С  не  более  6  ч,  в  дальнейшем  – замораживать. Кровь не замораживают! Допускается двукратное замораживание-оттаивание остального клинического материала.

 Транспортирование материала осуществляют в термоконтейнере с хладагентом не более 3 суток